Il momento rappresentato è il più drammatico del racconto evangelico, quando Gesù pronuncia la frase "In verità, vi dico, uno di voi mi tradirà", scatenando l'animarsi delle reazioni degli apostoli intorno a lui. La tensione degli astanti crea un movimento che si propaga dal centro verso l'esterno e che dalla figura di Cristo, la sola a rimanere immobile, si manifesta nei vari personaggi attraverso gesti e attitudini differenti. La figura di Gesù viene infatti isolata al centro della composizione, con le braccia tese di fronte a sè ad indicare il pane e il vino presenti sulla tavola. Gli Apostoli, collegati l'uno all'altro a piccoli gruppi di tre, sono divisi in quattro gruppi (due per lato) disposti tutti lungo il lato del tavolo opposto all'osservatore. A partire da sinistra sono raffigurati: Bartolomeo, Giacomo Minore, Andrea, Pietro, Giuda Iscariota, Giovanni. Sul lato destro sono invece dipinti: Giacomo Maggiore, Tommaso, Filippo, Matteo, Giuda Taddeo, Simone. Fa da sfondo alla composizione una parete sormontata da un soffitto a cassettoni, sulla quale si stagliano tre aperture, attraverso le quali si scorge un paesaggio in lontananza. Le due pareti laterali sono invece scandite da una serie di tendaggi, oggi purtroppo privi della decorazione originale a causa del degrado